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背景
胰腺癌(PC)作为全球第四大癌症相关死亡原因，通常被诊断为晚期。PC导致的死亡率不断上升，预计到年将成为肿瘤相关死亡率的第二大常见原因。到目前为止，PC的五年生存率仅为8%，大多数患者在手术后7年内死亡，表明PC患者的预后非常差。尽管对PC的遗传学研究已经发现了大量关键基因的改变，但是PC发展的分子机制仍有很多有待发现。因此，迫切需要寻找有效的治疗策略，以促进PC的早期发现并改善预后，如常见胰腺导管腺癌(PDAC)。
简介
年4月13日，来自福建医科大学胜利临床医学院的Yao?DongWang及其团队在JHematolOncol(IF:11.)发表名为CLK1/SRSF5pathwayinducesaberrantexonskippingofMETTL14andCyclinL2andpromotesgrowthandmetastasisofpancreaticcancer的研究[1]。
主要结果
CLK1在胰腺癌组织中的表达升高与PDAC患者预后不良相关
在由15对配对PDAC和正常胰腺组织组成的标本中进行高通量测序。CLK1被鉴定为唯一一个剪接相关的高表达基因(图1a)，并被选择用于后续实验。在大多数PDAC组织中，CLK1的转录水平高于成对的正常组织(图1b)。GEO和TCGA数据库结果也证实，CLK1在PDAC组织中的表达高于正常胰腺组织(图1c)。此外，CLK1mRNA(图1d)和蛋白(图1e，f)的进一步定量显示，胰腺癌组织的CLK1表达水平高于邻近的非肿瘤组织。此外，人胰腺癌细胞株PANC-1、、Aspc-1、SW、BxPC-3的CLK1蛋白表达高于正常的人胰管上皮细胞(HPDE)。在这些癌细胞中，PANC-1细胞CLK1水平最高，而BxCP-3细胞CLK1水平最低(图1g)。
图1.CLK1在人胰腺癌中的表达及预后价值
CLK1在体内外对人胰腺癌细胞生长均有促进作用
为了检查CLK1表达改变对胰腺癌生长的影响，选择了CLK1高表达的PANC-1细胞和CLK1低表达的BxPC-3细胞。首先，我们生成了具有稳定过表达的CLK1的BxPC-3细胞(图2a)和具有稳定敲除的CLK1的PANC-1细胞(图2b)。此外，产生了个具有稳定过表达或敲除CLK1的细胞。Te集落形成实验显示，BxPC-3细胞(图2c，E)和细胞中CLK1表达的增加可显著促进细胞增殖，而PANC-1细胞(图2d，E)和细胞中CLK1表达的减少显著抑制了细胞增殖。在CCK-8(图2f，h)和细胞计数(图2g，I)分析中观察到类似的模式，表明CLK1在体外人胰腺癌进展中的增殖作用。此外，我们的流式细胞术实验证明，CLK1对细胞增殖的主要影响与细胞周期的扰动有关，因为异位CLK-1表达降低了G2/M期的细胞百分比(图2j)，而CLK-1敲除诱导了对细胞周期期的相反影响(图2k)。
图2.CLK1增强人胰腺癌细胞体外及体内增殖能力
CLK1促进人胰腺细胞在体内外的迁移和侵袭能力
为了研究CLK1在PDAC转移中的作用，我们使用稳定过表达或敲除CLK1的PC细胞系进行迁移和侵袭试验。transwell分析实验的结果显示，BxPC-3细胞(图3a、b)和细胞中CLK1表达的显著升高促进了细胞迁移和侵袭，而PANC-1细胞(图3c、d)和细胞中CLK1表达的降低则显示出相反的效果。创面愈合试验中观察到了类似结果，表明CLK1的表达与体外BxPC-3细胞(图3e，f)、PANC-1细胞(图3g，h)和细胞的迁移和侵袭能力明显呈正相关。此外，我们还发现CLK1的过表达导致BxPC-3细胞向梭形间充质细胞转化(图3i)，同时增强了肿瘤细胞间的粘附。EMT标记物的定量分析显示，CLK1过表达与Bxpc-3细胞中E-钙粘蛋白表达减少和波形蛋白表达增加有关(图3k)。正如预期，在PANC-1细胞中敲除CLK-1对细胞形态和EMT产生相反的影响(图3j，l)。
图3.CLK1促进了人胰腺细胞在体内外的迁移和侵袭能力
CLK1广泛参与选择性剪接相关蛋白的磷酸化调节，特别是SRSF丝氨酸
为了探索CLK1在胰腺癌进展中的潜在机制，我们首先确定了不同CLK1表达对全基因表达水平的总体影响(图4a)。进一步的GO(图4b)和KEGG(图4c)分析发现，CLK1调控中差异表达的基因主要参与了细胞周期的调控，这与我们之前的验证是一致的。由于CLK1已被报道为一种磷酸化激酶和选择性剪接因子，因此我们进行了无标记磷酸化质谱分析(图4d)，以探索CLK1的靶磷酸化蛋白。鉴定了Te差异表达的磷酸化位点，其中39个基因上调，62个基因下调(图4e)。对所代表的蛋白进行GO分析发现，CLK1主要调控mRNA选择性剪接相关蛋白的磷酸化状态(图4f，g)。进一步GO分析发现，不同磷酸化状态的蛋白主要参与mRNA剪接的调控(图4h)。因此，与剪接密切相关的SR蛋白家族引起了我们的重视。在磷酸化水平下调的所有蛋白质中，我们发现Ser-上的SRSF5磷酸化水平显著。
图4.CLK1磷酸化人胰腺癌细胞丝氨酸上的SRSF5
CLK1介导的Ser上的SRSF5磷酸化有助于胰腺癌细胞的增殖和转移
为了探索Ser上的SRSF5磷酸化在调控PDAC细胞恶性行为中的作用，我们产生了可用于过表达具有以下同工型的SRSF5的慢病*：-Ser位点上的SRSF5突变(SMU)、-Ser位点上的模拟磷酸化(SP)和野生型SRSF5(SWT)(图5a)。对抗慢病*感染介导的靶基因在PANC-1细胞中的过表达(图5b)。集落形成(图5c)、transwell实验(图5d)和CCK-8增殖、细胞计数测定(图5e，f)显示，过表达的SRSFw，而不是SRSFm，促进了PANC-1细胞的细胞增殖和迁移，而TG处理则逆转了这一趋势。有趣的是，过表达的SRSFw在BxPC-3细胞中没有表现出类似的能力，而过表达的SRSF5-SP促进了BxPC-3细胞的增殖和转移。
图5.CLK1诱导的Ser上的SRSF5磷酸化促进胰腺癌细胞的增殖和转移
METTL14外显子10和CyclinL2外显子6.3的异常选择性剪接导致了PDAC病的临床预后
为了进一步阐明METTL14/CyclinL2选择性剪接与胰腺癌患者临床预后之间的关系，我们进行了PCR，并评估了52对PDAC样本中METTL14外显子10和CyclinL2外显子6.3的剪接百分比指数(PSI)。结果显示，在PDAC肿瘤样本中，METTL14外显子10的PSI升高，而CyclinL2外显子6.3的PSI降低(图9a)。我们还评估了临床样本中P-SRSF5的表达与METTL14和CyclinL2的PSI位移之间的关系，发现P-SRSF5的表达与METTL14外显子10的出现呈正相关(图9b)，与CyclinL2外显子6.3的出现呈负相关(图9c)。
图9.METTL14外显子10和CyclinL2外显子6.3的异常选择性剪接对PDAC患者具有预后价值
结论及展望
综上所述，我们首次系统评估了CLK1-SRSF5轴在胰腺癌发生中的作用，以及该通路的预后价值。在机制上，我们证明了CLK1-SRSF5轴通过促进Cyclin外显子6.3的跳跃来促进胰腺癌的增殖，并通过抑制METTL14外显子10的跳跃来增强细胞的迁移和侵袭能力。值得注意的是，我们首次证实了CLK1-SRSF5轴通过影响METTL14外显子10的选择性剪接模式，在胰腺癌中调控m6A甲基化的关键作用。此外，本研究也是世界上第一个报道m6A修饰相关蛋白的选择性剪接模式的改变。我们的下一个重点是鉴定导致METTL14外显子10跳跃移位的靶基因。本研究为靶向CLK1-SRSF5轴和m6A调控因子开发胰腺癌患者的有效治疗方案提供了新的思路。
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